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由于是一项新的检测，从新冠病毒所致疾病病程到新冠病毒核酸检测技术等各个方面都缺乏大量科学数据的支撑，各临床实验室在开展核酸检测的过程中也遇到了很多问题。如何保证核酸检测结果的及时性和准确性？怎样面对核酸检测中一些尚无标准的操作流程及其可能造成的一系列问题？别急，华西检验来帮你参考！ 01 新冠核酸检测疑问之技术原理 为什么荧光定量PCR会成为临床最广泛应用的检测方法？要满足临床对新冠病毒核酸检测的要求至少需要几个基因/位点？ 答：在疫情初期，面对新的病原体，最先检出的方法是NGS (next-generation sequencing)技术，暨下一代测序技术/高通量测序技术，并很快确定了新冠病毒的核酸序列。在病毒核酸序列确定的情况下，通过对其保守区域进行引物探针设计及靶向PCR检测无疑是最为简单及快速的检测策略。目前也有非常多的快速基因检测技术推出，如现场快速检验（POCT）技术等，整个检测流程缩短很长时间，有报道称最快可以节约3-4小时。和传统的荧光定量PCR（RT-PCR）技术相比，一体化现场快速检测确实便携、操作简单，但是如果过于强调其“快速”的特性，其灵敏度可能受影响，而现实的问题是传统PCR技术都受到的“假阴性”结果的挑战。在现有条件下，时间的缩短可能会带来一定程度的灵敏度的牺牲。从技术的角度看，在灵敏度和特异性的平衡上，相比较一些快速检测方法，目前平衡的最好的仍是RT-PCR检测技术。从过往的重大疫情来看，无论是西非埃博拉病毒、甲流还是中东呼吸综合征，RT-PCR仍是国家首推的检测手段。
目前新冠病毒核酸检测针对的位点主要包含病毒基因组中3段保守基因序列，即开放读码框1ab（Open reading frame 1ab，ORF1ab）、 核 壳 蛋 白 （Nucleocapsid protein，N）基因以及包膜蛋白(Envelop，E)基因作为检测靶标。根据国家卫健委发布的新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第四版），在实验室要确认一个病例为阳性，需满足同一份标本中新冠病毒的ORF1ab及N基因 2个靶标特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如受实验室检测试剂盒限制，只能做一个靶标的检测的话，应至少针对新冠病毒最为保守及特异的ORF1ab区域进行检测。
目前是否只能取呼吸道样本进行新冠病毒核酸检测？在其他类型样本中能检测到病毒核酸吗？ 答：在最新版的新冠肺炎诊疗方案中（第五版），其确诊所提到的样本类型包含了呼吸道样本以及血液样本，同时在实验室检查中增加了“粪便样本中可检测新型冠状病毒核酸”。由于新冠病毒造成的肺炎为下呼吸道感染，对于已有症状及肺部CT改变的患者来说，下呼吸道样本（如深部咳痰、灌洗液等）为核酸检测首选，而在新冠肺炎不同的病程中取上呼吸道样本（如鼻咽拭子等）也能检出病毒核酸；
随着对新冠病毒核酸检测的科技攻关，目前已有较多报道提出在患者的粪便样本中可检出病毒核酸，甚至有报道提出粪便样本的核酸检测阳性率高于上呼吸道样本。因此对于四川省内的医疗机构，省卫健委及时下发了《关于全面开展新型冠状病毒肺炎病人粪便标本核酸检测的通知》，并在日前刚刚发布了相应的粪便采集及核酸检测技术规范，粪便样本也将成为临床患者筛查的重要样本类型。目前我们华西团队已开始对呼吸道样本核酸检测确诊的患者进行治疗过程中及出院前的粪便样本进行核酸检测，研究结果显示粪便样本是病人诊疗过程中的一种非常好的检测目标，同时粪便核酸的阳性与病人的疾病进程的发展具有重要的相关性，可能作为一种治疗疗效评估和出院标准的重要检测指标。而目前我们华西团队对临床患者的血清和尿液样本进行病毒核酸检测还未检测出阳性结果。
临床已广泛开展新冠病毒RNA的荧光定量PCR检测，但是不同医院的实验室条件不同，对于样本核酸的提取采用的方法不一，那么提取的方法是否对检测结果有影响呢？ 答：荧光定量PCR是临床分子检测中常用的检测方法，在以往采用RT-PCR对病毒核酸进行的检测中，磁珠法是较为常用的核酸提取方法，普遍认为其对病原体的核酸提取具有简便、高效、提取浓度及纯度较高等优势。此外因各实验室条件不同及针对的病毒的试剂盒不同，离心柱法、煮沸裂解法、一步裂解释放法等也在临床大量应用。不同的病毒核酸提取方法因其提取产物浓度、纯度的差别以及对RNA的保护程度不同，将在一定程度上影响病毒核酸尤其是临界阳性样本的核酸检出。病毒核酸提取方法的选择对于最终的检测结果的影响非常重要，建议各实验室根据自身情况合理选择，有条件可进行一定量的比对试验作为选择的依据。根据我们目前现有条件，我们初步对患者原始样本（带病毒保存液的咽拭子样本）采用不同提取方法后的检测结果显示：分别采用离心柱法及磁珠法提取后，PCR检测的CT值无显著差异（p＞0.05），节选某一样本的结果图如下：
02新冠核酸检测疑问之实验室生物安全对于条件有限的实验室，能否简单总结一些进行核酸检测的人员到底应该怎样防护？实验室应至少提供什么条件？答：新冠病毒目前暂按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理。根据最新版的新冠病毒实验室生物安全指南，如无法对原始样本进行可靠的灭活，则对其进行的核酸检测应当在生物安全二级实验室进行，同时采用生物安全三级实验室的个人防护（建议至少穿戴工作服、一次性工作帽、双层手套、医用一次性防护服、医用防护口罩或动力送风过滤式呼吸器、防护面屏或护目镜、工作鞋或胶靴、防水靴套），各实验室还可根据自身情况增加进一步的防护；同时标准预防、不定期通风和手卫生等重要的防护措施必不可少。
在物资匮乏及实验室条件不足等限制下，实验室应根据物资短缺的情况，启动分层的生物安全防护预案。建议至少应对直接面对病人的窗口工作人员和接触呼吸道样本的相关人员严格执行生物安全三级防护，其他实验室检测人员酌情采取生物安全二级或一级防护，同时加强所有实验室人员的安全意识，检测后按照相关的生物安全要求对进行新冠病毒核酸检测操作的安全柜、台面及实验室环境及时进行有效的消毒
进行核酸检测的实验室人员携带病毒回家的可能性？每日核酸检测工作结束后的消毒建议?答：在日常进行新冠病毒核酸检测的实验室内，所有实验人员均应严格遵循新型冠状病毒实验室生物安全指南（最新版）中的相应要求，在实验室环境适时消毒、实验人员安全防护到位、实验操作严格按照相应生物安全进行的情况下，实验室核酸检测人员下班后携带病毒回家的可能性是较小的。
结束核酸检测工作后，应注意严格按照相关文件要求进行防护装备的脱卸，注意尽量少地触碰到污染面，且脱卸的每一步后均应有手消毒，防护服、医用帽及医用口罩等一次性物品尽量不重复使用，在全部脱卸完成后，再进行相应的手卫生及消毒。对于严格分区的实验室，在相应区域完成防护装备脱卸及手卫生即可进入清洁区。对于条件有限的实验室，在完成防护装备脱卸、处理及手卫生后，建议喷洒75%酒精等进行有效消毒后，再离开实验室。
关于原始的样本的灭活，目前文件及指南中提到多个温度条件，是否会造成核酸检测结果的差异？ 答：目前最新的新冠病毒核酸检测专家共识中，建议采用56℃水浴45min，并可根据提取试剂在标本裂解时所采用的温度调整灭活温度，但不低于56℃，同时也建议灭活条件有预实验结果支持。根据我们目前的初步试验结果来看，同一阳性样本经过56℃干浴30min以及65℃干浴30min后，其PCR检测的阳性CT值无明显差异，节选某一样本的结果图如下
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